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（2）小型肝細胞

正常成熟ラット肝臓から分離した肝細胞を、Nicotinamideと増殖因子（EGF, TGF-alpha, or HGF）を加えて培養すると、大型の肝細胞の中に明らかに小さな細胞集団が出現する（図1）。核の形や性状は肝細胞と同様で細胞質も充実していることから形態学的には肝細胞そのものであるが、明らかに小さい。周りの細胞の1/2?1/3の大きさで培養経過と共に更に小さくなる。

肝臓をコラゲナーゼで灌流し、得られた細胞分散液を低速遠心（50xg 1分間）すると、肝細胞が沈殿し、上清中には類洞構成細胞と肝細胞の一部（小型肝細胞を含む）、血液細胞が含まれている。この上清を50xgで5分間遠心を行うと、血液細胞を除く細胞が沈殿する。同様な操作を繰り返して小型肝細胞を多く含む分画を得る。この分画中には、cytokeratin8陽性細胞が約35％、cytokeratin19陽性細胞が約0.3％､desmin陽性細胞が約10％、vimentin陽性細胞が約18％、SE1陽性細胞が約20％、ED1/2陽性細胞が約8％含まれている（Mitaka T, et al. Hepatology, 1999）。この分画の細胞を培養皿に播種して､nicotinamideとEGF､10％FBS、ascorbic acid 2-phospateを含む培養液で培養すると、小型肝細胞が増殖し、 10日目には20?30個の細胞からなるコロニーを形成する。

図1

図1. 培養6日目に見られた小型肝細胞コロニー

BrdUや3H-thymidineを用いてラベリングすると、1核の細胞が固まって増殖していることがわかる（図2）。加えて、それらの細胞はアルブミンを作っている。このことはこれらの小型の細胞は肝細胞であることを示している。

図2

図2. 培養6日目の小型肝細胞コロニー。BrdUで48時間ラベルした（褐色の核）。アルブミンとの二重染色。

これらの結果は、成熟肝細胞の中に小型肝細胞になる能力を持つ細胞が含まれていることを示めしている。

図3

図3. 小型肝細胞コロニー形成。培養皿の同一箇所を位相差顕微鏡で観察し、毎日撮影した。数字は培養後日数。矢頭は小型肝細胞を示す。

図3を見るとわかるように、コンパクトなコロニーを形成する小型肝細胞の他に、敷石状に上皮様な形態をとり、核が黒っぽく見える肝上皮様細胞と平板状の大きな細胞質を持つ星細胞が増えている。小型肝細胞の表現型をまとめたものが表1である。

表1

小型肝細胞の特徴と関連文献
  1. 特徴　(関連文献：1-4,10,17-19)
    • 小型肝細胞は、Albumin分泌能などの肝細胞としての基本的な機能をは保持しているが、AFP発現などの未熟細胞の特徴は有しない
    • 成体ラット肝細胞の約1.5％が小型肝細胞としての能力を有する
    • 加齢と共にその割合は減少する
    • 凍結保存後も小型肝細胞としての能力を維持する
    • CD44を特異的に発現するが、成熟化に伴い消失する
    • ヒアルロン酸（CD44のリガンド）上では、無血清で選択的に増殖
  2. 増殖機序　(関連文献：5,6,16,22)
    • EGF, HGF, TGFaによって増殖が促進され、TGFb、Activin Aにより増殖抑制を受ける
    • Follistatinを分泌し、増殖抑制因子Activin A及びActivin Bの活性を中和する
  3. 成熟化と組織化　(関連文献：7-9,12-15,21)
    • 非実質細胞との相互作用により基底膜を形成し、成熟化・組織化する
    • 毛細胆管形成と細胞極性
  4. ヒト小型肝細胞　(関連文献：11,16,20)
    • ヒト正常肝臓中にもヒト小型肝細胞は存在し、分離培養可能である
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（2）小型肝細胞
（2）-1 小型肝細胞の特異性
（2）-2 小型肝細胞の増殖
（2）-3 小型肝細胞の成熟化
（2）-4 肝細胞機能
（2）-5 組織化と毛細胆管形成
（2）-6 ヒト肝臓に見られる小型肝細胞

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