肝臓の再生　(Liver Regeneration)

肝臓が再生することは、ギリシア神話に登場するプロメテウスを例に出してよく紹介される。プロメテウスは、人間に「火」を与えた罪で、コーカサスの山頂で生きながらにして毎日肝臓を大鷲についばまれる責め苦を強いられる。不死のプロメテウスの肝臓は夜中に再生し、ヘラクレスにより解放されるまで半永久的に責め苦が続く、と云うお話しである。それほど昔から知られていた現象であるが、科学的に証明したのはHiggins GM & Anderson RMが1931年Archives of Pathologyに報告したのが最初である。ラットの肝臓は大小6つの葉(lobe)からできているが、その大きな葉2つで全体の約2/3の体積を占める。その2つの葉を根本で結紮切除する2/3部分肝切除(partial hepatectomy; PH)を行うことができる。正常ラット・マウスを用いると約1週間でほぼ元の大きさ（重さ）に戻る。切り取った葉が新たにできるわけではなく、残った4つの葉が大きくなるので正確には代償性肥大(compensatory hypertrophy)である。しかしながら、肝臓はどこをとってもほぼ一様な組織であるので、切除した組織と同等な組織が、消失した分増えていることやヒトや豚など分葉していない肝臓においても同様に再生することからラットにおいても代償性肥大といわず再生としている。

肝臓の再生と云えば、この部分切除後の再生を指すことが多いが、成体肝臓における再生には、その主体となる細胞により大きく分けて3つの機序がある。

（1）多数の肝細胞の消失が急速に起こった場合である。物理的に切除された場合や四塩化炭素（CCl₄）など肝細胞毒による肝細胞壊死による消失後の再生がこれに相当する。この場合、成熟肝細胞の増殖により消失分は補塡されるため、肝細胞主体の再生といえる(hepatocyte-mediated regeneration)。

（2）肝細胞の増殖が抑制された状態で多数の肝細胞消失が起こった場合である。2-アセチルアミノフルオレン（2-acetylaminofluorene; 2-AAF)のような発癌剤を投与したラットに部分肝切除やCCl4を投与した場合やガラクトサミン投与、 エチオニン添加コリン欠乏食投与、3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydro-collidine (DDC)後の肝再生がこれに相当する。後者の場合、オーバル細胞（Oval cells）と呼ばれる、小型で楕円形の核を持つ細胞がグリソン鞘（Glisson’s sheath）から細胆管(bile ductules)に類似した管腔構造を呈し、小葉内に向かって増生する。残存肝細胞とオーバル細胞の境界部分には、好塩基性の細胞質を持つ小型な肝細胞が出現し、オーバル細胞の消退と入れ替わるように肝細胞に置き換わっていく。このような再生は、幹・前駆細胞が主体となる肝再生と云える(stem/progenitor cell-mediated regeneration)。

• ＊最近の研究により、このような場合も胆管周囲や中心静脈周囲に存在する肝細胞が再生を担っていることが報告されるようになり、幹細胞主体の再生か否か議論がある。

（3）アルカロイドの一種であるRetrorsineを投与し肝細胞の分裂を抑制した状態で部分肝切除や四塩化炭素投与を行った場合である。内在性の小型肝細胞様前駆細胞(small hepatocyte-like progenitor cells; SHPCs)の増殖巣が多数出現し、一ヶ月ほど立つと周囲の肝細胞と見分けのつかない様になり、肝臓は再生する。

成体動物肝臓において形態学的に確認されている肝幹・前駆細胞はオーバル細胞と小型肝細胞の2種のみで、報告されている他の細胞は表面抗原をターゲットにFACSなどを用いて肝臓組織から分離した細胞で、その頻度は極めて低くまた肝臓常在の細胞か否かはっきりしないことが多い。

ヒト肝疾患においても動物に見られるような肝再生がみられる。生体肝移植は、肝臓の持つ旺盛な肝再生能力を利用した代表的な治療法である。正常な肝臓を50〜70％切除してレシピエントの病的肝臓と交換するのであるから、ドナーもレシピエントの肝臓どちらも再生しないと成り立たない治療法である。外科手術後の肝再生の機序については、多くの研究がなされ大方解明されている。実験ラット肝臓ではオーバル細胞(Oval cells)をよく認めるがヒト肝疾患では稀である。よく見られるのは細胆管反応(ductular reaction)と呼ばれる細い胆管の増生像であり、胆管疾患に伴ってみられることが多い。

日本における肝疾患の多くは肝炎ウイルスに起因する。B型、C型肝炎による慢性肝炎と肝硬変症、肝癌である。B型ウイルス感染により劇症肝炎（大部分の肝細胞が感染・壊死する状態）を発症することはあるが、多くは比較的少数の肝細胞が徐々に感染・壊死する病態になり慢性化する。感染初期は、失われた肝細胞の補塡は近隣の肝細胞の分裂により行われるが、何度も分裂が起こると次第に分裂能力を失い、埋められなくなった隙間に活性化星細胞が浸入し、分泌したコラーゲン線維がその隙間を埋めていく、いわゆる線維化が起こる。皮膚でみられる創傷治癒と同じ過程がこの時期に起こる。これが慢性肝炎の後期にみられる肝線維化であり、肝硬変症の始まりである。線維化が始まる前の時期に小型の肝細胞の集団がよく認められる。小型の肝細胞からなる再生結節は肝硬変ではよく見られる。そのような小型の肝細胞は、成熟肝細胞が増殖できない状態が生じた時に、肝細胞の中に紛れていた増殖能の高い前駆細胞（progenitor cell）が 姿を現したものと我々は考えている。

我々の見出した小型肝細胞（small hepatocyte）と、ヒト肝臓で見られる小型の肝細胞とは同じ由来ではないかと考え、この小型肝細胞について研究することで肝再生医療、創薬研究、人工肝臓作製の早期実現に繋げたいと考えている。

これまでの研究成果は、下記の項目を参照して欲しい。

肝幹・前駆細胞と小型肝細胞

（1）オーバル細胞（Oval cells）

（1）-1 Hering管（Canals of Hering）

（1）-2 細胆管（CoH）から肝細胞への分化

（2）小型肝細胞

（2）-1 小型肝細胞の特異性

（2）-2 小型肝細胞の増殖

（2）-3 小型肝細胞の成熟化

（2）-4 肝細胞機能

（2）-5 組織化と毛細胆管形成

（2）-6 ヒト肝臓に見られる小型肝細胞

（3）オーバル細胞と小型肝細胞

（1）オーバル細胞（Oval cells）

オーバル細胞は、Emmanuel Farber が肝化学発癌過程において発癌剤投与初期にグリソン鞘(Glisson’s sheath)周囲に出現する楕円形の核を持つ未分化な細胞として最初に報告した。

• Farber E: Similarities in the sequence of early histological changes induced in the liver of the rat by ethionine, 2-acetylamino-fluorene, and 3’ methyl-4-dimethylaminoazobenzene. Cancer Res 16: 142-148, 1956

2-acetylaminofluorene (2-AAF), d-galactosamine, allyl alcohol, furan, 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)などの薬剤で誘導されることが知られている。

ある特定のタンパク質を発現していれば確実にオーバル細胞と見なしてよいとされるマーカーは未だ見つかっていない。オーバル細胞を同定するために、ケラチン（cytokeratin: CK）7, CK19, OV6, mouse A6 antigen, α-フェトプロテイン(α-Fetoprotein: AFP), Thy1, c-kit, CD34, Dlk-１などのいずれかのマーカーの組み合わせがよく用いられる。

オーバル細胞の由来については、グリソン鞘周囲に存在し、胆管様構造を呈し、ヘリング管(canal of Hering)細胞と形態が類似することなどからヘリング管由来と考えられているが、未だに議論があるところである。

Thy1, c-kit, CD34は、骨髄の造血幹細胞でもよく発現していることから骨髄由来の細胞の可能性もあるが、その頻度は非常に低い（1％以下）と考えられている。

図1. オーバル細胞（Oval cells）
ガラクトサミン投与ラット肝臓に出現したオーバル細胞。D3,D4は薬剤投与後の日数

（1）オーバル細胞（Oval cells）

（1）-1 Hering管（Canals of Hering）

（1）-2 細胆管（CoH）から肝細胞への分化

（2）小型肝細胞

正常成熟ラット肝臓から分離した肝細胞を、Nicotinamideと増殖因子（EGF, TGF-alpha, or HGF）を加えて培養すると、大型の肝細胞の中に明らかに小さな細胞集団が出現する（図1）。核の形や性状は肝細胞と同様で細胞質も充実していることから形態学的には肝細胞そのものであるが、明らかに小さい。周りの細胞の1/2?1/3の大きさで培養経過と共に更に小さくなる。

肝臓をコラゲナーゼで灌流し、得られた細胞分散液を低速遠心（50xg 1分間）すると、肝細胞が沈殿し、上清中には類洞構成細胞と肝細胞の一部（小型肝細胞を含む）、血液細胞が含まれている。この上清を50xgで5分間遠心を行うと、血液細胞を除く細胞が沈殿する。同様な操作を繰り返して小型肝細胞を多く含む分画を得る。この分画中には、cytokeratin8陽性細胞が約35％、cytokeratin19陽性細胞が約0.3％､desmin陽性細胞が約10％、vimentin陽性細胞が約18％、SE1陽性細胞が約20％、ED1/2陽性細胞が約8％含まれている（Mitaka T, et al. Hepatology, 1999）。この分画の細胞を培養皿に播種して､nicotinamideとEGF､10％FBS、ascorbic acid 2-phospateを含む培養液で培養すると、小型肝細胞が増殖し、 10日目には20?30個の細胞からなるコロニーを形成する。

図1. 培養6日目に見られた小型肝細胞コロニー

BrdUや³H-thymidineを用いてラベリングすると、1核の細胞が固まって増殖していることがわかる（図2）。加えて、それらの細胞はアルブミンを作っている。このことはこれらの小型の細胞は肝細胞であることを示している。

図2. 培養6日目の小型肝細胞コロニー。BrdUで48時間ラベルした（褐色の核）。アルブミンとの二重染色。

これらの結果は、成熟肝細胞の中に小型肝細胞になる能力を持つ細胞が含まれていることを示めしている。

図3. 小型肝細胞コロニー形成。培養皿の同一箇所を位相差顕微鏡で観察し、毎日撮影した。数字は培養後日数。矢頭は小型肝細胞を示す。

図3を見るとわかるように、コンパクトなコロニーを形成する小型肝細胞の他に、敷石状に上皮様な形態をとり、核が黒っぽく見える肝上皮様細胞と平板状の大きな細胞質を持つ星細胞が増えている。小型肝細胞の表現型をまとめたものが表1である。

小型肝細胞の特徴と関連文献

1. 特徴　(関連文献：1-4,10,17-19)
   • 小型肝細胞は、Albumin分泌能などの肝細胞としての基本的な機能をは保持しているが、AFP発現などの未熟細胞の特徴は有しない
   • 成体ラット肝細胞の約1.5％が小型肝細胞としての能力を有する
   • 加齢と共にその割合は減少する
   • 凍結保存後も小型肝細胞としての能力を維持する
   • CD44を特異的に発現するが、成熟化に伴い消失する
   • ヒアルロン酸（CD44のリガンド）上では、無血清で選択的に増殖
2. 増殖機序　(関連文献：5,6,16,22)
   • EGF, HGF, TGFaによって増殖が促進され、TGFb、Activin Aにより増殖抑制を受ける
   • Follistatinを分泌し、増殖抑制因子Activin A及びActivin Bの活性を中和する
3. 成熟化と組織化　(関連文献：7-9,12-15,21)
   • 非実質細胞との相互作用により基底膜を形成し、成熟化・組織化する
   • 毛細胆管形成と細胞極性
4. ヒト小型肝細胞　(関連文献：11,16,20)
   • ヒト正常肝臓中にもヒト小型肝細胞は存在し、分離培養可能である

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2. Mitaka T, Sattler GL, Pitot HC, Mochizuki Y. Characteristics of Small Cell Colonies Developing in Primary Cultures of Adult Rat Hepatocytes. Virchows Archiv B Cell Pathology, 62(5), 329-335 (1992)
3. Mitaka T, Norioka K, Nakamura T, Mochizuki Y. Effects of Mitogens and Co-mitogens on the Formation of Small-Cell Colonies in Primary Cultures of Rat Hepatocytes. J. Cell. Physiol., 157(3), 461-468 (1993)
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5. Mitaka T, Kojima T, Norioka K, Mochizuki Y. TGF-? Completely Blocks the Formation of Small-Cell Colonies: Effects of Mito-inhibitory Factors on the Proliferation of Primary Cultured Rat Hepatocytes. Cell Struct. Funct., 20(2), 167-176 (1995)
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1. Mitaka T. The current status of primary hepatocyte culture. Internat. J. Exp. Pathol., 79, 393-409 (1998) Review
2. Mitaka T, Sato F, Mizuguchi T, Mochizuki C, Mochizuki Y. Growth and Differentiation of Small Hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 13 (SUPPL.), S70-77 (1998) Review
3. Mitaka T. Reconstruction of hepatic organoid by hepatic stem cells. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 9(6), 697-703 (2002) Review
4. Mitaka T, Ooe H. Drug Metabolism Reviews focusing on drug transporter interactions in the liver: Characterization of hepatic-organoid cultures. Drug Metab Rev, 42(3):472-481 (2010) Review

（2）小型肝細胞

（2）-1 小型肝細胞の特異性

（2）-2 小型肝細胞の増殖

（2）-3 小型肝細胞の成熟化

（2）-4 肝細胞機能

（2）-5 組織化と毛細胆管形成

（2）-6 ヒト肝臓に見られる小型肝細胞

（3）オーバル細胞と小型肝細胞

肝再生時に出現するOval cellと小型肝細胞の関係

オーバル細胞は、形態学的には類似しているが表現型は一様ではなく、分化段階に幅のある細胞群と考えることができる。未熟な細胞から肝細胞や胆管細胞の特徴を強く持つ細胞まで含まれるが、どちらの細胞にも分化可能であることが重要である。

ガラクトサミン投与ラット肝臓においては、中心静脈周囲の肝細胞が壊死するが、門脈周囲領域に炎症細胞と共にオーバル細胞が出現する。その後にオーバル細胞と肝細胞の境界部に好塩基性の細胞質を持つ小型の肝細胞が出現し、それらの細胞は投与後7〜10日ほどで消失し、正常肝細胞に置き換わって再生が終了する（図１）。オーバル細胞は小型の肝細胞を介して成熟肝細胞に分化すると考えられてきた。我々は、この系で出現する小型の肝細胞と我々の見出した小型肝細胞（small hepatocytes）が同じ細胞であるとの仮説を立て、その検証とガラクトサミン投与ラット肝臓における再生機序を研究した。

図1. d-Galactosamine投与後の肝再生。Oval cellsの出現と小型肝細胞の出現の時間軸と位置関係。
(Kon J,et al. J Hepatology, 2006)

オーバル細胞を同定するために表面マーカーの一つであるThy1を用いた。小型肝細胞のマーカーとしてCD44を用いた。ガラクトサミン投与後2日目にThy1陽性細胞が門脈周囲域に出現する。3日目に最大となり以後急速に減少する（図２）。一方、投与後3日目からThy1陽性細胞と肝細胞との境界領域にCD44陽性の肝細胞が多数認められ、4日目に最大となり以後徐々に減少する。Thy1／CD44両陽性の肝細胞も一過性に出現する。CD44陽性細胞は7日目にはほぼ消失し、炎症も治まりほぼ正常な肝小葉となる。この結果は、ガラクトサミン投与後の肝再生過程に出現する小型の肝細胞は、small hepatocytesと同じ表現型を持つ細胞で一過性に出現し成熟肝細胞に分化することを示している。

図2. d-Galactosamine(GalN)投与後の肝再生におけるThy1陽性細胞とCD44陽性細胞の出現。Thy1陽性細胞は、グリソン鞘内には筋線維芽細胞など多数存在しているが、GalN投与後 2日目にグリソン鞘周囲にも出現し、3日目に最大となり、以後著減し、5日目には消失。CD44陽性細胞は、胆管上皮細胞や血球系の細胞に発現しているが、GalN投与後3日目にグリソン鞘近傍の小葉内に出現する。4日目に最大となり、以後減少する。
(Kon J,et al. J Hepatology, 2006)

図3. 薬剤投与モデルラット肝臓に出現するCD44陽性小型肝細胞。

ガラクトサミン投与して2日目の肝臓から分離したThy1陽性細胞からは、CD44陽性小型肝細胞コロニーの形成は稀であったが、3日目からの細胞は多くのコロニーを形成した。薬剤投与後４日目の肝臓から分離したCD44陽性細胞は3日目から分離した細胞に比較して、より多くのコロニーを形成した。またThy1陽性細胞をコラーゲンゲル内で培養することで胆管を形成させることができた。分離した細胞の遺伝子発現を調べた結果、薬剤投与後2日目から分離したThy1陽性細胞は肝細胞を特徴付ける遺伝子をほとんど発現していないが、3日目から分離した細胞では、Thy1陽性細胞、CD44陽性細胞の順に肝細胞への分化が進んでいることがわかった（図4）。

図4. ガラクサミン投与ラット肝臓から分離した細胞の肝分化関連遺伝子の発現をGeneChipを用いて解析した。2日目と3日目から分離したThy1陽性細胞、4日目のCD44陽性細胞、正常ラット肝臓から分離し10日間培養した小型肝細胞（SH）、成熟肝細胞を用いた。
(Kon J et al. Am J Pathol, 2009)

それぞれの細胞を肝臓に移植して肝細胞として生着し増殖するか調べると、Thy1, CD44, MHsの順に生着効率が高くなる。Thy1由来の細胞巣は移植後2ヶ月後には消失するが、移植したMHsは1年後もほぼ全て生存している。多くのCD44細胞は移植後2ヶ月を過ぎると消失していくが一部は長期に生存する。

CD44陽性肝細胞が成熟肝細胞に由来するのか、それともオーバル細胞が分化した細胞なのかについて、ガラクトサミン投与ラット肝臓からThy1, CD44陽性細胞を分離・培養し、検討した。2日目から分離したThy1陽性細胞は、EGF, HGF, aFGFによりCD44陽性細胞に誘導され、Matrigel投与により成熟化させることができる。しかしながら、Thy1陽性細胞から誘導されるCD44陽性肝細胞の少ない頻度を考慮すると、一過性に出現する小型肝細胞の多くは成熟肝細胞由来である考えるのが好ましく、また一見成熟化し既存の肝細胞と共存するかのように振る舞うが、生体が危急の状態から脱するとともに消失していく運命にあるのではないかと考えられる。

これらの結果は、ガラクトサミン障害肝の再生において出現するオーバル細胞の一部は、CD44陽性小型肝細胞を介して肝細胞に分化するが、その多くは既存の肝細胞が正常化するに従い不要となり消失していくことを示唆している。

1. l   Kon J, Ooe H, Oshima H, Kikkawa Y, Mitaka T. Expression of CD44 in rat hepatic progenitor cells. J Hepatology, 45(1), 90-98 (2006)
2. Kon J, Ichinohe N, Ooe H, Chen Q, Sasaki K, Mitaka T. Thy1-positive cells have bipotential ability to differentiate into hepatocytes and biliary epithelial cells in galactosamine-induced rat liver regeneration. Am J Pathol, 175(6): 2362-2371 (2009)
3. Ichinohe N, Kon J, Sasaki K, Nakamura Y, Ooe H, Tanimizu N, Mitaka T. Growth ability and repopulation efficiency of transplanted hepatic stem, progenitor cells, and mature hepatocytes in retrorsine-treated rat livers. Cell Transplantation, 21(1): 11-22 (2012)
4. Ichinohe N, Tanimizu N, Ooe H, Nakamura Y, Mizuguchi T, Hirata K, Kon J, Mitaka T. Differentiation capacity of hepatic stem/progenitor cells isolated from d-galactosamine-treated rat livers. Hepatology, 57(3): 1192-1202 (2013)